Juan Diego Botto es hijo de la actriz y profesora de interpretación Cristina Rota. Hermano de las actrices María Botto y Nur Levi. Con tan solo tres años de edad, en 1978, Juan Diego Botto y su familia se exilian a España y fijan su residencia en Madrid
Juan Diego estudió interpretación en la escuela fundada por su madre, el Centro de Nuevos Creadores, con sede en la Sala Mirador, por donde han pasado algunos de los mejores actores y actrices españoles. Más tarde se trasladó a Nueva York para continuar sus estudios bajo la dirección de Uta Hagen.
Su primera aparición en el cine fue con tan sólo 5 años en la película Juego de poder, de Fausto Canel (1983). Durante su adolescencia en la década de los 80 hace pequeños papeles en película e incluso consigue un rol permanente en la famosísima serie de televisión norteamericana "El Zorro". En 1992 es elegido por Ridley Scott para hacer de hijo de Cristóbal Colón en el film "1492: La conquista del Paraíso". Tres años después protagoniza la película que marcaría el inicio de una fructífera y exitosa carrera interpretativa, "Historias del Kronen", de Montxo Armendáriz con la que alcanzó gran éxito y popularidad.
"Martín Hache", de Adolfo Aristarain, "Silencio roto", de Montxo Armendariz, o "Plenilunio" de Imanol Uribe, “Vete de mí” de Victor García León hacen resonar su nombre en el cine y posibilita que otros directores internacionales de renombre cuenten él en el reparto de películas como "The dancer upstairs", de John Malkovich, "Bordertown", de Gregory Nava, o "El Greco", de Iannis Smaragdis, con la que obtuvo el premio al Mejor Actor en el Festival Internacional de El Cairo. Ha estado nominado en tres ocasiones a los Premios Goya.
Pero su carrera cinematográfica no le ha alejado de los escenarios teatrales, en los que ha trabajado no sólo como actor, sino como dramaturgo y director de escena. La obra "Hamlet", dirigida e interpretada por él fue estrenada en el Teatro María Guerrero con gran éxito en Madrid y en su gira por toda España.
En 2005 dirigió la obra "El privilegio de ser perro", escrita por él mismo. También ha escrito "Despertares y celebraciones", dirigida por Cristina Rota, y "La última noche de la peste", dirigida por Víctor García León. Actualmente gira por España y Latinoamérica la obra “Un trozo invisible de este mundo” un texto suyo dirigido por Sergio Peris Mencheta y protagonizada por él mismo y Astrid jones. El texto de esta obra ha sido publicado en un ensayo más amplio del autor por Espasa bajo el título “Invisibles...voces de un trozo invisible de este mundo”